Comparison of Conventional RT-PCR and Real-time RT-PCR Assays for Diagnosis of Grapevine fanleaf nepovirus (GFLV)*

Year 2016, Volume: 45 Issue: 2-3, 53 - 62, 30.12.2016

Serkan Önder , İsmail Can Paylan , Mustafa Gümüş

Abstract

Recently advances in biotechnology and molecular
biology have played a significant role in development of serological and
molecular assays for detection of plant viruses. However, specificity and
sensitivity of them may show variation according to pathogens and hosts. In
this study, Grapevine fanleaf nepovirus
(GFLV) which was the most prevalent viral agent in Aegean viticulture
production areas was used to compare conventional RT-PCR and real-time RT-PCR.
For this purpose, 8 infected and 5 healthy, totally 13 symptomatic grapevine samples
which have been detected by DAS-ELISA were used. After the conventional RT-PCR
and real-time PCR assays, results were evaluated agarose gel electrophoresis
and melting analysis respectively. The conventional RT-PCR results showed that
10 out of 13 samples were infected with GFLV, whereas 11 out of 13 samples were
found infected with real-time RT-PCR. At the end of this study, the real-time
RT-PCR assays were found more sensitive, reliable and rapid than conventional
RT-PCR.       

Keywords

Grapevine, GFLV, RT-PCR

References

• Akbaş, B. and Erdiller, G. 1993. Researches on Grapevine Virus Diseases and Determination of Their Incidences in Ankara, Türkiye. Journal of Turkish Phytopath. Soc. V. 22(2-3): 47-54. Akdoğan, N. 1956. Kısa Boğum (Degeneressans Infecteus). Sakarya Ziraat Mücadele Enstitüsü Halk Broşürleri No:5 İstanbul. S.6. Akdoğan, N. 1958. Kısa Boğum “Bulaşık Soysuzlaşma”. Ziraat Vekaleti T.E.S.C. 102. Akdoğan, N. 1965. Bağlarda Bulaşık Soysuzlaşma (Kısa Boğum) ve Korunma Çareleri. Yenilik Basımevi, İstanbul s 8. Anonim, 1999. Bağ Entegre Mücadele Teknik Talimatı. T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı. Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü, Ankara, 1999. Anonim, 2009. Real-time PCR Kursu Ders Notları, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Moleküler Mikrobiyoloji Laboratuvarları, Ankara. Azeri, T. ve Çiçek, Y. 1995. İntrodüksiyon ve Klon Seleksiyonuyla Elde Edilmiş Bazı Bağ Çeşitleri ve Anaçlarındaki Virüs ve Virüs Benzeri hastalıkların Saptanmasına Yönelik Araştırmalar. VII. Türkiye Fitopatoloji Kongresi. Adana. 26-29 Eylül 1995, s. 374-377. Azeri, T. and Fidan, Ü. 1988. Virus and Virus-Like Diseases Effecting Grapevine and Growing Virus-Free Grapes in the Aegean Coast. Proc. Of the V. Congress of Turk. Phyt. Soc. Oct. 1988, Antalya, Türkiye. Borja, M.J. and Ponz, F. 1992. An appraisal of different methods for the detection of the walnut strain of cherry leaf roll virus. Journal of Virological Methods, 36:73-83. Chou, Q., Russel, M., Birch, D., Raymond, J. and Bloch., W. 1992. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications. Nucleic Acid Res. 20 (7), 1717-1723. Çığşar, İ. 2002. Güneydoğu Anadolu Bölgesi ve Nevşehir İllerinde Bağlarda Zararlı Virüs ve Virüs Benzeri Hastalıkların Biyolojik ve Serolojik Yöntemlerle Saptanması ve İki Yeni Nepovirüsün Karakterizasyonu. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, s.111. Çığşar, İ., G.P. Martelli and Digiaro, M. 2002. Sanitary Status of Grapevines in South-eastern and Central Anatolia (Turkey). OEPP/EPPO Bulletin 32: 471-475. Çığşar, İ. ve Yılmaz, M.A. 1998. Güneydoğu Anadolu Bağlarında Görülen Virüs Hastalıklarının Serolojik Yöntemlerle Saptanması. Türkiye VIII. Fitopatoloji Kongresi Bildirileri. Ankara, 21-25 Eylül 1998, s. 154-157. Erdiller, G. 1982. Kısa Boğum Hastalık Etmeninin Morfolojik ve Serolojik Özellikleri ve Standart Irklarla Karşılaştırılması Üzerine Araştırmalar. A.Ü. Zir. Fak. Yayınları. 834 Bil. Araş. ve İncelemeler 496 s. Golino, D.A., Verdegaal, P., Rowhani, A. and Walker, M.A. 1992. Sampling procedures to find nepoviruses in grapevines need improvement. Calif. Agric., 46:11-13. Kaya, A. ve Erilmez, S. 2014. Detection of Viruses in Aegean Region Grapevines. J. Turk. Phytopath.Vol:43 No:1-3, 45-57. Mackay, L.M., Arden, K.E. and Nitsche, A. 2002. Survey and Summary Real-time PCR in Virology. Nucleic Acids Research, Vol.30, No:6, 1292-1305. Martelli, G.P. 1987. Virus and Virus-like Diseases of Grapevine in Turkey. A Report to the Government of Turkey. Published by FAO: Rome 1987. Martelli, G.P. and Boudon-Padieu, E. 2006. Directory of Infectious Diseases of Grapevines and Viroses and Virus-like Diseases of the Grapevine: Bibliographic Report 1998-2004, CHIEAM, 2006. Martelli, G.P., Walter, B. and Pink, L. 2001. Grapevine fanleaf virus. CMI⁄AAB Description of Plant Viruses No. 385, Kew, Surrey, Commonwealth Mycological Institute⁄Association of Applied Biologists. Martelli, G.P. and Savino, V. 1990. Fanleaf degeneration. In: Pearson RC, Goheen AC (eds), Compendium of Grape Diseases, St. Paul, MN, APS Press, pp. 48–49. Osman, F., Leutenegger, C., Golino, D. and Rowhani, A. 2007. Real-time RT-PCR (TaqMan®) assays for the detection of Grapevine leafroll associated viruses 1–5 and 9. J. Virol. Methods 141, 22–29. Osman, F., Leutenegger, C., Golino, D. and Rowhani, A. 2008. Comparison of low-density arrays, RT-PCR and real-time TaqMan® RT-PCR in detection of grapevine viruses. J. Virol. Methods 149, 292–299. Osman, F. and Rowhani, A. 2006. Application of a spotting sample preparation technique for the detection of pathogens in woody plants by RT-PCR and real-time PCR (TaqMan). J. Virol. Methods 133, 130–136. Özaslan, M., Baloğlu. S. ve Yılmaz, M.A. 1991. Kahramanmaraş Bölgesi’nde Lokal Olarak Yetiştirilen Üzüm Çeşitlerinde Virüs Hastalıkları. VI. Türkiye Fitopatoloji Kongresi. Türkiye Fitopatoloji Derneği. Bildiriler, s.401-406. Özaslan, M., Baloğlu. S. and Yılmaz, M.A. 1993. Virus Diseases of Grapevine in South-eastern Anotolian Region in Türkiye. 11.Th Proc. Of. Icvg. Montreux, Switzerland. No:62 Ep. P. 122. Özaslan, M. ve Yılmaz, M. 1995. Adana, Tarsus, Gaziantep, Şanlıurfa ve Adıyaman Bölgelerinde Yetiştirilen Bağlara Zarar Veren Virüs Hastalıkları. VII. Türkiye Fitopatoloji Kongresi. Adana, 26-29 Eylül 1995, s.306-312. Rowhani, A., Walker, M.A. and Rokni, S. 1992. Sampling strategies for the detection of grapevine fanleaf virus and the grapevine strain of tomato ringspot virus. Vitis, 31:35-44. Sànchez, F., Chay, C., Borja, M. J., Riwhani, A., Romero, J., Bruening, G., and Ponz, F. 1991. cDNA sequence of the capsid protein gene and 3′ untranslated region of a fanleaf isolate of grapevine fanleaf virus. Nucleic acids research, 19(19), 5440-5440. TÜİK, 2013, Türkiye İstatistik Kurumu, Bitkisel Üretim İstatistikleri 2013, Erişim Tarihi: 28Temmuz 2015. Zipper, H., Brunher, H. and Bernhagen, J. 2004. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acid Res. 32 (12), e103.